Esclerosis Múltiple: La ausencia de chaperonas H2-O de moléculas clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC), causa susceptibilidad a enfermedades autoinmunes
La ausencia de chaperonas H2-O de moléculas clase II del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC), causa susceptibilidad a enfermedades autoinmunes
Lack of the MHC class II chaperone H2-O causes susceptibility to autoimmune diseases
Welsh, R, A.; Song, Nianbin; Foss, C, A.; Boronnina, T.; et al
PLoS Biol. 2020, 18 (2): 1-29 (Open Access)
https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000590
Resumen
El DO (en humanos HLA-DO; H2-O en ratones) es un complejo mayor de histocompatibilidad no clásico y altamente conservado de clase II (MHC II). Una molécula accesoria expresada principalmente en médula tímica y células B. Reportes previos sugirieron posibles asociaciones entre DO y autoinmunidad, infección por virus de hepatitis C (HCV) y cáncer; aunque no están claros los mecanismos por los cuales se produce la contribución del DO.
En este estudio, combinando varias aproximaciones que incluyeron, dilución de péptidos, reacción de linfocitos mezclados, secuenciación profunda del receptor de célula T (TCR); enumeración de tetrámeros guías de precursores vírgenes de células T CD4 e imagen corporal total; reportamos que el DO afecta el repertorio de péptidos autopresentados por células B y epitelio tímico. El DO induce efectos diferenciales en la presentación de epítopes y selección tímica; en consecuencia altera las frecuencias de precursores de células T CD4. Nuestros hallazgos fueron validados en dos modelos de enfermedades autoinmunes por demostración que la ausencia de DO aumenta la autorreactividad y susceptibilidad al desarrollo de patologías autoinmunes
Material y métodos
Declaración ética
Todos los animales de estudio fueron aprobados (M017M307) por el comité institucional de cuidado de animales de la Universidad John Hopkins, de acuerdo con el Acta de Bienestar Animal. Los animales fueron sacrificados por inhalación de isofluorano o CO2 antes de los estudios ex-vivo
Ratones:
Se adquirieron ratones C57BL/6 (B6) y ratones I-Ab+-H2-O−/− (DO-KO). Los usados en los experimentos fueron generados por cruzamiento inverso. .
Se utilizaron además ratones H2-O−/−). Los ratones originales transgénicos HLA-DR1 (DRB10101) (DR1), expresan una fusión de la molécula MHC II que contiene el gancho de unión DR1 y el dominio proximal de membrana de molécula murina I–E. Los ratones DR1+DO-KO se obtuvieron por cruce de ratones DO-KO con ratones transgénicos DR1 por más de 10 generaciones para conseguir homocigotidad DO-KO. Los DR1+DO-WT se obtuvieron por cruce de ratones DR1 con B6 por más de 10 generaciones. Todos los ratones DR1+H2-O todavía expresaban moléculas I-Ab.
Péptidos y proteínas:
El colágeno (280–294), el péptido (CAGFKGEQGPKGEPGP) y el péptido MOG (35–55) (MEVG-WYRSPFSRVVHLYRNGK) fueron sintetizados a >98% de pureza. Las proteínas bCII (con grado de inmunización) se compraron.
Tetrámeros y anticuerpos:
El tetrámero PE-conjugado MOG y los monómeros biotinilados DR1 se ordenaron a NIH Tetramer Core Facility (Atlanta, GA). Los tetrámeros PE-conjugados DR1/Colágeno II (280–294) se elaboraron utilizando monómeros CLIP/DR1 y un tetrámero núcleo NIH. Para el experimento de citometría de flujo; el violeta brillante 421-CD44, flúor Alexa 700-CD4, PE-Cy7-CD8, FITC-CD3, BV421-CD25, Alexa 647-Foxp 3, APC-B220, APC-CD11c, PE-Cy7-CD69, y APC-F4/80 fueron adquiridos a Biolegend y la fijación de viabilidad con eFlúor 700, fue de eBioscience.
Dilución de péptidos
El total de células B de bazos de ratones vírgenes DO-WT y DO-KOf fueron aisladas magnéticamente previo a lisis celular con 1% de NP-40 durante 1 hora a temperatura ambiente. El lisado se centrifugó a 40.000 g para remover debritos celulares antes de la inmunoprecipitación de moléculas de I-Ab. Para la aislación I-Ab, el aclarado del lisado celular fue rotado durante la noche a 4ªC en presencia de un anticuerpo anti-I-Ab (clon Y-3P) acoplado a resina. Las moléculas MHC fueron diluidas del anticuerpo Y-3P por dilución ácida débil (0.1% TFA). Los péptidos se aislaron vía TFA al 1% y dilución con MeOH al 40%. Los residuos de detergentes se removieron en columnas removedoras de detergentes y columna HILIC, antes del lavado sobre LC-MS.
Ensayo de supresión Treg
Tregs de ratones vírgenes para DO-WT y DO-KO se aislaron de bazos de ratones usando kit de aislamiento CD4+CD25+. Células T vírgenes de CD4+ fueron aisladas magnéticamente de ratones DO-WT y marcadas con violeta trazador celular. La estimulación de CD28 se produjo por APC aisladas por depresión Thy 1,2. Se brindó anti-CD3 soluble a todas las líneas. La concentración de Tregs por línea varió, por lo tanto la relación Treg:célula T por línea fue de: 1:1, 1:2, 1:4, y 1:8. Las células se cultivaron 72 horas antes del análisis FAC.
Inmunización y MLR modificado
Ratones B6 o DO-KO fueron sacrificados retirándose el bazo; éste se procesó y resuspendió a 200 x 106 céls/ml en PBS estéril. Ratones receptores por vía intraperitoneal recibieron 30 × 106 células/ratón. En los días 8–9 postimmunización; los esplenocitos de ratones inmunizados se usaron como células respondedoras para reestimulación in-vitro. Las células B estimuladoras para experimentos de reestimulación se aislaron de bazos DO-WT o DO-KO y por selección negativa y tratadas con 200 ng/mL de LPS por 48 horas antes de irradiación con 800 rads para destruir células T contaminantes. Células respondedoras y estimuladas fueron cocultivadas en una proporción de 1:9; el tiempo de cultivo dependió del tipo de ensayo.
Espectrometría de masa
Los péptidos limpios fueron analizados por nano-LC/MSMS QE_plus usando una corrida de 60 minutos. El espectro del tándem MS2 fue procesado usando 3 nodos: común, Xtract y procesador MS2. El espectro MS/MS fue analizado con Mascot v.25.1, usando la base de datos 2015RefSeq con señuelos concatenados especificando la especie de ratón; se usó el software Proteome para validar las bases de péptidos MS/MS y las identificaciones proteicas. Las identificaciones de péptidos solo se aceptaron si mostraban una probabilidad >98% y falsos negativos <1%.
Ensayos de proliferación celular
Para medir la respuesta de células T CD4 en MLR modificado; las células respondedoras cultivas fueron cosechadas 1 semana después de la primera vuelta de reestimulación in-vitro y teñidos con Celltrace CFSE antes de su mezcla con células B estimuladoras. Alrededor del 5-6 día luego de la segunda reestimulación, las células cultivadas fueron cosechadas y teñidas con anticuerpos fluorescentes para citometría de flujo. Para verificar el porcentaje de células precursoras respondedoras a; o bien, líneas estimuladoras o proliferación modelada.
La PF representa la fracción de células de cada condición de cultivo que re-experimentaron al menos una ronda de división debida a estimulación antigénica.
La secuenciación TCR de cDNA de lisados, fueron sujetos a secuenciación TCR-beta profunda CDR3. Como controles vírgenes TCR, células T CD3+ y CD4+, provenientes de bazos de ratones vírgenes DO-WT o DO-KO y ratones también fueron asignados a secuenciación profunda.
Estudios PF de células T CD4
Células de ratones teñidas con tetrámeros MOG PE-conjugados, o tetrámeros PE conjugados CII PE. Las células tetrámero positivas se aislaron vía anti-PE y sujetas a análisis por citometría de flujo. Para medir las respuestas de células T CD4 in MLR modificado, células respondedoras cultivadas fueron cosechadas 1 semana después de la primera vuelta de re-estimulación antes de mezclar con células estimuladoras B para una segunda ronda de re-estimulación. Las células cultivas fueron cosechadas y teñidas.
Inducción de Enfermedad (EAE y CIA)
Inducción de EAE: en ratones B6 y DO-KO, éstos recibieron 2 inyecciones subcutáneas de MOG35-55 en CFA (4 mg/ml de M. tuberculosis) en la base de la cola, junto con una inyección de toxina Pertusis intraperitoneal. Los ratones inmunizados recibieron dos días después 200 ug de toxina Pertusis intraperitoneal. Los ratones fueron evaluados visualmente por investigadores no relacionados con el ensayo para detectar síntomas neurológicos y parálisis de miembros.
Inducción de CIA: para inducir CIA en ratones machos DR1+ DO-WT o DR1+ DO-KO, recibieron una inyección intradérmica (en la base de la cola) de 100 ug de proteína bovina CII en CFA. El día 21 postinmunización, los ratones recibieron inmunización en base de la cola con colágeno. Los ratones fueron evaluados visualmente por el desarrollo de inflamación de articulaciones.
Imágenes in-vivo por fluorescencia IR
Imágenes de EAE: tanto los ratones enfermos como controles vírgenes DO-WT y DO-, fueron coinyectados IV con tinción anti CD4 marcada y anti-MBP. Los animales fueron sacrificados 72 horas post inyección; posteriormente se hicieron imágenes de animales y órganos, las colocalizaciones se identificaron por la intensidad de la imagen amarilla
Imágenes CIA: los animales afectados de CIA se inyectaron IV con 4 nmol de prueba de colágeno y anticuerpo anti-CD4. Cuarenta y ocho horas después, los ratones afectados fueron sacrificados y se tomaron imágenes ex-vivo. Las colocalizaciones se determinaron por la intensidad de la señal amarilla de las imágenes superpuestas.
Recuperación ex-vivo de células infiltrates de tejidos en SNC de ratones enfermos con EAE
Ratones enfermos DO-WT y DO-KO se extirparon cerebros y el tejidos fue digerido mediante colagenasa D. Las células mononucleares fueron aisladas en un gradiente percólico 70%/30% 37% durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Recuperación ex-vivo de tetrámeros CII en células específicas
Los ratones artríticos se inyectaron con 4 nmol de prueba de colágeno IV y 150 ug de IRDye800CW-tetrámero conjugado CII intradérmico en plantas. Se obtuvieron imágenes de los animales 1, 24, 48 y 72 horas post inyección. A las 72 h post-inyección, los ratones enfermos fueron sacrificados y extrajeron los ganglios poplíteos, luego teñidos con anticuerpos fluorescentes para citometría de flujo.
Detección de alteración en la presentación MOG35–55 usando 2D2 Tg de ratón
Los ratones afectados de EAE fueron sacrificados y sus cerebros, médulas espinales e infiltrados de células mononucleares fueron agrupados. Los infiltrados APC fueron aislados. Los APC provenientes de drenaje de ganglios linfáticos periféricos también se aislaron. Ambos tipos de APC fueron irradiados con 800 rads para prevenir proliferación durante el tiempo de cultivo. Las células respondedoras T CD4 fueron aisladas de bazos de ratones hembras, colocadas en portaobjetos y teñidas para análisis FCS.
Curva de concentración MOG35–55.
Las células T CD4 de ratones transgénicos 2D2 se aislaron y marcadas con trazador celular violeta antes de co-cultivar con células esplénicas DO-WT o DO-KO B irradiadas. Las células B y T fueron colocadas en una relación 1:1 para un total de 2 × 105. Se añadieron varias concentraciones de MOG35–55 (0, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 10 μM) por 48 h a 37˚C antes de tinción y análisis FACS. Todas las condiciones experimentales fueron triplicadas.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron usando Graphpad Prism. El índice de diversidad Simpson y los cálculos de rearreglo se realizaron usando herramientas Adaptive Biotechnologies. A menos que se especifique lo contrario todos los tests fueron “t” de Student, las barras representan promedio ± SEM.
Discusión y conclusiones
Las enfermedades autoinmunes afectan a más de 23,5 millones de americanos, número que continúa creciendo todos los años. Como tales, se están realizando grandes esfuerzos para comprender los factores de riesgo que contribuyen a su desarrollo. Debido a que GWAS ha sido asociado a desarrollo de enfermedades autoinmunes y SNPs DO, y dado que DO se expresa selectivamente en médula tímica, donde T CD4 y CD8 sufren selección negativa, la pérdida de epítopes de presentación propios en ratones DO-KO, podría resultar en selección inadecuada de células T CD4. Buscamos clarificar el rol del DO en la regulación CD4 y presentación antigénica periférica in-vivo. Existen distintas teorías sobre como el DO afecta los niveles de complejos pMHC; en una el DO habría evolucionado simplemente para inhibir la función de DM. En otra, el DO coopera con DM, asegurando la selección efectiva de epítopes basado en la naturaleza de esos. Pero no existen estudios in-vivo usando ratones DO-KO y evidencia in-vivo que apoye cada modelo
En este ensayo, usando múltiples aproximaciones y dilución de péptidos de ratones DO-KO vírgenes y células DO-WT junto con múltiples aproximaciones, incluyendo MLR modificado para detección de pMHCII, secuenciación profunda TCR de ratones DO-KO vírgenes y células T CD4 DO-WT, comparación de precursores de células T CD4 precursores de MOG CII. Finalmente evaluamos susceptibilidad a CIA y EAE. Estas aproximaciones apoyan el modelo de que DO funciona cooperativamente con DM en la prevención de enfermedades autoinmunes. Además, investigamos poblaciones Treg y encontramos un aumento del porcentaje de Tregs en ratones DO-KO vírgenes en relación a ratones DO-WT; aunque los Tregs de ratones DO-KO no se desempeñaron mejor en ningún modo que Tregs DO-WT en ensayos de supresión in-vitro.
La evaluación de diferencias en los repertorios de diluciones de péptidos generados en células B de ratones que no expresan DO usando algoritmos de predicción IEDB, mostraron que las células DO-WT presentan un gran pool de péptidos únicos, con registros de ligadura que tuvieron mayor afinidad que la correspondiente a diluciones de péptidos DO-KO. Estos hallazgos sugieren que en ausencia de DO, el DM no está cercano al repertorio de péptidos sino solo con aquellos con alta afinidad de ligadura.
Posteriormente hipotetizamos que la ausencia de DO podría llevar a la presentación de cantidades alteradas de ciertas moléculas pMHCII, afectando la delación en timo. La enumeración de frecuencias de precursores T CD4 para epítopes inmunodominantes de dos autoantígenos; por ejemplo CII(280-294), altamente estable y DM sensible y MOG(38-51), que se postula DM resistente; apoyan nuestra hipótesis. Ratones DO-KO mantienen un aumento PF de MOG(38-51) específico de células T CD4, consistente con fallas en deleción tímica. En contraste, encontramos PF inalterada de CII(280-294) en células T CD4 de ratones DO-KO.
La evidencia clara de que DO juega un rol crítico en la protección frente a enfermedades autoinmunes, proviene de modelos CIA y EAE. Cuando testeamos ratones DO-KO para el desarrollo de EAE, encontramos comienzo más rápido del trastorno que se correlacionó con aumento en la infiltración de células T CD4 por imágenes NIRF. El poder de imágenes NIRF proviene de detección de desmielinización por anticuerpos marcados para MBP dentro de SNC. Además es capaz de detectar colocalización de células T CD4 en tejidos de SNC, que permite el estado de la enfermedad. En forma similar, un empeoramiento en el desarrollo de CIA en ratones DR1+DO-KO comparados con ratones DR1+DO-WT es un poderoso instrumento de diseño.
En EAE los mayores niveles PF para MOG(38-51) específico de células T en ratones DO-KO, correlacionan bien con desarrollo acelerado de la enfermedad. Por el contrario, a pesar de la similitud en PF para el CII(280-294) específico de células T CD4 en ratones DR1+DO-KO y DR1+DO-WT, los DR1+DO-KO mostraban más severa degradación CII. Estos hallazgos sugieren que en CIA, una mayor presentación de complejos CII(280-294) en periferia podría ser el principal responsable de mayor severidad en ratones DO-KO. En consecuencia, el DO puede afectar la presentación de ambos epítopes, DM resistente MOG(38-51) y CII (280-294) DM-sensible. Estas observaciones brindan fuerte evidencia que la pérdida de función DO lleva a un mayor repertorio de células T CD4, el cual cuando se activa acelera el desarrollo de enfermedades. Sin embargo, deberían profundizarse las investigaciones.
En conclusión, hemos documentado las diferencias en los repertorios de TCR CD4 mostrados en ratones DO ha mostrado que la selección negativa de células T CD4 pueden ser controladas por DO en los epítopes DM-sensibles de células T. Estas observaciones in-vivo apoyan los hallazgos bioquímicos que DO trabaja con DM para optimizar la selección de epítopes clase II.
Es de notar que DO es filogenéticamente posterior al DM que se evidenció en vertebrados al mismo tiempo. Nuestro reporte evidencia claramente que la ausencia de DO se asocia con mayor susceptibilidad a enfermedades autoinmunes; lo que oportunamente permitiría el mejor seguimiento y pronóstico de pacientes en riesgo o con enfermedades autoinmunes.